SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝膠電泳常見(jiàn)問(wèn)題及分析

如何防止聚丙烯酰胺垂直電泳漏膠現象已成為實(shí)驗室研究人員比較頭疼的問(wèn)題！
　　1.  固定玻璃板時(shí)，先將厚薄玻璃板在桌面對齊后在垂直面上稍微向厚板傾斜20度，使底面薄板略高于厚板。
　　2. 將固定好的玻板固定于放有海綿墊的制膠架上，固定時(shí)用手稍用力往下壓，此時(shí)封閉的灌膠系統準備完畢。
　　3.  除了以上安裝技巧外，由于海綿橡膠墊用久后會(huì )老化或者損壞，從而導致漏膠的現象時(shí)常發(fā)生，建議用戶(hù)可以購買(mǎi)粘性高柔軟性好的橡膠墊。

　　常見(jiàn)問(wèn)題及分析
　　1. 配膠緩沖液系統對電泳的影響？
　　在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導電性與電場(chǎng)強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓梯度，壓著(zhù)蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。
　　所以，pH對整個(gè)反應體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應首要考慮該因素。
　　2. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？
　　聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；
　　制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進(jìn)行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。
　　3.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
　　主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。
　　處理辦法：待其充分凝固再作后續實(shí)驗。
　　4. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？
　　主要出現在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
　　處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

　　5. 為什么帶出現拖尾現象？
　　主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。
　　處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(cháng)，重新配制；降低凝膠濃度。
　　6. 為什么帶出現紋理現象？
　　主要是樣品不溶性顆粒引起的。
　　處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。